一篇Theranostics教你如何设计EMT(上皮间质转化）相关的国自然思路

上皮间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT），是上皮细胞通过特定程序转化为间充质细胞的生物学过程。EMT有助于细胞的迁移，发生 EMT的肿瘤细胞由于粘附能力显著减弱，非常容易随着体液循环跑到别处作威作福，引发肿瘤的转移。因此EMT作为肿瘤研究的一个重要方向，阐明调控恶性肿瘤细胞发生EMT过程的分子机制，明确其在恶性肿瘤的发生、发展、转移中的病理意义，并探索基于EMT关键分子的诊断方法及靶向EMT关键分子的治疗手段是肿瘤转移中EMT机制研究的关键科学问题。

那么肿瘤中的EMT该如何进行研究，如何将其与我们熟知的其他分子调控机制联系起来？今天给大家分享的是一篇国自然EMT研究文章（IF 8.579）“Non-canonical signaling pathway of SNAI2 induces EMT in ovarian cancer cells by suppressing miR-222-3p transcription and up regulating PDCD10”，文章从miRNA角度出发，阐明了上皮性卵巢癌中从miRNA上游调控因子到下游靶基因再到EMT相关通路的一整套完整的EMT调控机制，文章思路清晰，是国自然EMT研究申请中不错的借鉴范本。

一、立项依据

上皮性卵巢癌（EOC）是女性最致命的恶性肿瘤，通常以中晚期形式呈现，是妇科癌症死亡的最常见原因。EOC高死亡率的主要原因是癌细胞侵入邻近器官或转移至腹膜腔。然而，导致EOC细胞转移的潜在分子机制尚不清楚。明确EOC细胞的侵袭或转移机制有助于开发靶向转移的有效疗法，改善OC患者的整体生存率。

EOC细胞的转移通常伴随着上皮间质转化（EMT），即细胞间粘附能力的丧失以及迁移和侵袭性状的获得。EMT的重要标志是E-cadherin（E-cad）表达下调，转录因子SNAI2的激活和波形蛋白（VIM）的表达上调也是EMT发生的关键因素。此外，Wnt /β-catenin通路被认为是内皮细胞EMT的开关，β-catenin内皮信号传导在肿瘤进展中至关重要，高水平的β-catenin信号传导可导致肿瘤细胞迁移和肿瘤转移。然而，肿瘤进展中驱动EMT信号传导的分子机制尚不明确。

miRNA在各种生理和病理条件下参与了基因的转录后调控。研究人员曾报道miR-222-3p可通过靶向子宫内膜癌中的ERα来促进细胞增殖和肿瘤转移。尽管已有研究显示miR-222在癌症转移中起着至关重要的作用，但miR-222-3p在EOC细胞迁移中的确切机制尚不清楚。

为探究miR-222-3p在EOC转移中的具体分子机制，改善当前EOC抗转移治疗的策略，研究人员进行了如下预实验：

1. miR-222-3p与EOC细胞迁移的分析

研究人员首先对38例EOC组织和16例健康组织中miR-222-3p的表达量进行了分析，结果显示miR-222-3p在EOC中显著低表达。随后对4种EOC细胞系中miR-222-3p的表达量进行分析。

2. miR-222-3p靶基因PDCD10与EOC细胞迁移的分析

为确定miR-222-3p的下游调控靶基因，研究人员首先利用生信软件miRDB，TargetScan，PicTar和miRTarbase进行了预测，对交集基因进行GO和KEGG富集分析，挑选与“细胞黏附”相关的15个基因进行后续研究。敲减/过表达细胞中的miR-222-3p，分析各基因的表达变化，结果显示PDCD10与miR-222-3p表达负相关程度最大。TargetScan预测结果显示miR-222-3p能与PDCD10 3’UTR结合。利用qPCR及WB对4种EOC细胞系中PDCD10的mRNA和蛋白水平进行检测，并利用WB检测细胞中PDCD10与miR-222-3p表达相关性，结果显示负相关。

3. miR-222-3p靶向PDCD10影响下游通路的分析

为确定PDCD10与EOC的相关性，研究人员利用GEO和TCGA数据集分析了PDCD10表达水平与患者预后的相关性。随后为确定EOC中PDCD10可能参与介导的调节通路，对TCGA中的EOC数据集进行了GSEA分析，结果显示PDCD10表达水平与EMT和Wnt通路相关基因正相关。对PDCD10敲减/过表达细胞中的E-cad和VIM以及β-catenin和TCF4的mRNA和蛋白水平进行分析，结果显示E-cad与PDCD10表达负相关，VIM与PDCD10表达负相关，β-catenin和TCF4的表达与PDCD10表达正相关。

4. miR-222-3p上游转录因子的分析

为确定miR-222-3p的上游调控因子，研究人员利用JASPAR数据库进行了分析，结果显示miR-222-3p启动子区有转录因子SNAI2的结合位点，且miR-222-3p启动子区H3K9me3和H3K36me3相关组蛋白的修饰水平较高。敲减/过表达SNAI2，结果显示miR-222-3p的前体和成熟体表达水平与SNAI2负相关。

因此，基于以上预实验结果，研究人员提出如下科学假说：高表达的转录因子SNAI2可以抑制miR-222-3p的转录，解除miR-222-3p对靶基因PDCD10的抑制作用，高表达的PDCD10通过激活EMT和β-catenin/ Wnt信号通路，促进EOC细胞的迁移。与此同时，低表达的SNAI2呈现相反的调控作用。假说图如下：

二、研究内容

1.EOC中miR-222-3p表达分析

1）多因素Cox回归分析结果显示EOC组织中低表达的miR-222-3p与低风险比相关，肿瘤转移数量与高风险比相关。

2）对miR-222-3p高/低表达的细胞系分别进行miR-222-3p敲减/过表达处理，利用Transwell和伤口愈合实验分析细胞迁移变化，结果表明miR-222-3p抑制EOC细胞迁移。

2. miR-222-3p与靶基因PDCD10 分析

1）为进一步确定miR-222-3p与PDCD10的相关作用关系，研究人员分别构建了miR-222-3p结合位点突变和未突变两种PDCD103’-UTR荧光素酶载体，结果显示敲减/过表达miR-222-3p，能影响结合位点未突变载体的荧光素酶活性而不影响结合位点突变载体。

2）为确定miR-222-3p靶基因PDCD10的功能，研究人员进行了体外细胞功能回复实验，结果显示敲减/过表达PDCD10能逆转miR-222-3p敲减/过表达引起的细胞迁移变化及PDCD10 mRNA和蛋白水平的变化，且影响力比敲减/过表达miR-222-3p更大。

3）为进一步确定EOC中PDCD10的功能，研究人员又进行了体内验证实验，结果显示过表达PDCD10能逆转miR-222-3p对肿瘤转移及PDCD10蛋白表达的抑制作用。体内成像系统显示过表达miR-222-3p，小鼠体内的转移结节数量明显降低，而过表达PDCD10后，转移结节数量增加到与对照组相似水平。IHC和HE染色结果同样表明过表达miR-222-3p，肿瘤转移减弱，而过表达PDCD10，肿瘤转移增强。

3. miR-222-3p通过EMT和Wnt /β-catenin信号通路抑制细胞迁移

1）为进一步确定EOC中PDCD10与EMT的相关性，研究人员利用免疫荧光进行了分析，结果显示PDCD10过表达能影响表达E-cad和VIM的细胞形态和空间位置变化。Operetta高成像系统显示过表达PDCD10能增强EMT通路相关蛋白的免疫荧光。功能回复实验表明在PDCD10过表达的细胞中过表达miR-222-3p，E-cad水平上调，VIM水平下调。

2）为进一步确定Wnt /β-catenin信号通路参与了PDCD10调控的EOC转移，研究人员利用TOP flash / FOP flash双荧光素酶报告系统进行了分析，结果显示过表达PDCD10能增强荧光素酶活性。免疫荧光和Operetta高成像系统分析结果显示过表达PDCD10能显著增强β-catenin水平。功能回复实验表明在PDCD10过表达细胞中过表达miR-222-3p，β-catenin水平降低。

4. SNAI2抑制miR-222-3p转录和EOC细胞迁移

1）为进一步确定SNAI2对miR-222-3p的转录调控作用，研究人员对SNAI2结合位点进行启动子缺失分析，并通过ChIP实验进行验证。

2）为分析SNAI2与EOC迁移的相关性，研究人员进行了体外细胞表型实验，敲减/过表达SNAI2，Transwell和伤口愈合实验分析细胞迁移情况。随后进行功能回复实验，结果显示敲减/过表达SNAI2，能显著逆转miR-222-3p敲减/过表达引起的细胞迁移变化。

5. SNAI2通过miR-222-3p/PDCD10/Wnt /β-catenin信号通路促进细胞迁移

qPCR检测EOC患者中SNAI2，miR-222-3p和PDCD10表达水平，结果显示SNAI2和PDCA10之间表达正相关。与此同时，qPCR结合WB检测结果显示敲减/过表达SNAI2后，细胞中PDCD10的mRNA和蛋白水平与SNAI2正相关。TCGA数据分析结果显示EOC组织中的PDCD10，SNAI2，CDH1，CTNNB1和VIM之间具有表达相关性。

三、技术路线 

四、研究目标

1. 阐明miR-222-3p调控PDCD10转录进而影响EOC细胞迁移的分子机制；

2. 阐明PDCD10介导的EMT和Wnt /β-catenin信号通路在miR-222-3p调控的EOC细胞迁移中的具体调节机制；

3. 阐明转录因子SNAI2参与调节miR-222-3p/PDCD10调控的EOC细胞迁移的具体分子机制。

五、特色与创新之处

1. 本文揭示了一种非常规的SNAI2诱导EMT的途径，丰富了对转录因子SNAI2调控功能的认识；

2. 通过多数据库联用以及生信预测分析，结合已发表的研究成果，从上游转录因子SNAI2到下游靶基因PDCD10，再到调控通路及细胞表型变化，全面阐述miR-222-3p在EOC迁移中的功能机制；

3. 文章揭示了EOC转移相关的SNAI2 / miR-222-3p / PDCD10轴，针对该功能性调控轴进行干预性治疗有助于提高EOC的治疗效果。

本文阐述了其他肿瘤中已有研究的miR-222-3p在EOC细胞迁移中具体调控机制，证明了转录因子SNAI2、miR-222-3p和靶基因PDCD10三者之间的表达调控关系，同时分析了它们参与调控EMT中转移相关通路Wnt /β-catenin的具体机制。文中运用了大量的临床样本及公共数据确保数据分析的可靠性，对每个调控机制均进行了细胞功能回复实验，研究思路清晰明了，逻辑环环相扣。不足之处在于创新性相对较弱，miR-222-3p在其他肿瘤中已被证明与转移相关。本文基于前人研究基础对EOC中miR-222-3p进行分析缺乏一定的创新性，另外从基因上游到下游再到通路的分析流程固然经典，但稍显老套。因此如果我们后面打算在国自然申请中继续沿用该分析流程，可以考虑加入新的元素如结合蛋白、泛素化等，这样会给课题设计增加不少新亮点，提高中标率。

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